酵素具有區域和立體選擇性(Regio- and stereoselectivity)，產物較少出現異構物，除此之外，不同於化學合成需要高溫或高壓的極端環境，酵素反應的條件更溫和，反應的溶液通常對環境比較友善，因此使用酵素製造高價值產品具有相當大的優勢。這篇文獻回顧詳細的將利用酵素製造高價值產品的流程進行拆解，依序介紹如何發現新酵素、如何生產重組酵素、如何改良酵素、如何用酵素生產產品以及可以用酵素生產甚麼。
如何發現酵素?
發現酵素途徑通常來自微生物，傳統方式是透過環境檢體分離並培養微生物，再對微生物進行全基因體定序來找到新酵素，雖然這個方法侷限在可以培養的微生物，但仍然持續找到新功能的酵素，例如從Streptomyces albulus菌株中發現非核醣體胜肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase; NRPS)，能夠合成重複同樣胺基酸的胜肽，共發現兩個這類的酵素，homopoly(ε-L-lysine) synthetase和homopoly(L-diaminopropionic acid) synthetase。
由於不是每種微生物都能夠成功培養，另外一種方式是從環境檢體萃取總DNA或mRNA，再克隆到異源宿主表達，透過功能性篩選找出符合目標用途的酵素，不過這種方法受限於序列是否能夠在異源宿主上表現，常見原因為轉錄、轉譯、蛋白質摺疊和前驅物不相容。
隨著多體學的發展，也開始有人直接利用轉錄體學、蛋白質體學和代謝體學對環境檢體進行探勘。單細胞技術(Single cell genomics)也可以用來直接分析環境檢體中的菌種並分析其中的酵素。除此之外，直接從頭設計人工酵素(de novo enzyme design)也是一種取得新功能酵素的方法。
如何生產重組酵素?
生產重組酵素的方法是將構築質體轉型到宿主中表達，宿主可以是細菌或真核生物，而構築質體方法有限制酶、同源黏合和同源重組。
以細菌或真核細胞當宿主的差別在於細菌繁殖速度快、整體花費比較便宜，但是真核細胞能夠用來生產需要後轉譯修飾、複雜結構折疊和大分子複合體蛋白，所以選擇宿主要考量重組蛋白的特性是否可以被達成。
構築質體的方法有限制酶、同源黏合和同源互補。
限制酶方法又再細分為Type II 和Type IIS限制酶。Type II限制酶是在目的基因加上限制酶切位，以限制酶切割後產生黏性末端，再黏到質體上，不過限制酶切位被連接酶接合後有機率使切位壞掉，因此使用Type II限制酶切割及黏合的次數是有限的。Type IIS限制酶則是利用一種辨認限制酶序列，但是切割在序列上游或下游的限制酶進行剪接，這種方法不會影響到限制酶序列，著名的Golden Gate cloning就是使用這種方法。
同源黏合方法分為Overlap extension PCR (oePCR)、脲嘧啶切割和Chew back and annealing。oePCR方法是利用目的基因尾端4-8bp互補的序列做Primer，Primer後面序列是另一個片段的12-60bp同源序列，透過PCR的升溫暴露出單股DNA(ssDNA)，DNA聚合酶的延伸連結兩個片段。脲嘧啶切割方法是利用在5’尾端的脲嘧啶經由酵素切除，產生5’端小片段序列，讓其掉落後與另一片段的同源序列進行互補黏合。Chew back and annealing方法中最有名的是Gibson DNA assembly，以T5 exonuclease吃掉一部分5’端序列，再經由Phusion DNA polymerase修復同源序列，最後以Taq ligase黏合缺口(Nick)，因為整個反應只需要在等溫50C進行，又被稱為等溫DNA組裝(Isothermal DNA assembly)。
同源重組代表性的方法為Gateway cloning，這個方法是利用λ phage鑲嵌和離開E. Coli基因體的機制。目的基因的attB序列可以與質體上的attP序列重組，產生attL和attR鑲嵌到質體上。
如何改良酵素?
改良酵素的方向為提升穩定度、產量、受質範圍或賦予新功能，改良方法可分為隨機(Random)、半理性(Semi-rational)和理性(Rational)設計。
隨機設計通常以Error-prone PCR產生隨機變異，但是這種變異受限於序列變異頻率的不同，有些序列變異率比較高，有些比較低，而無法讓每個位置都產生變異。因此目前的新技術為Sequence Saturation Mutagenesis (SeSaM)，能夠確保每個位置都達到足夠的變異，Twist Bioscience就是提供這種服務的公司。
理性設計則是針對已知的功能性位置進行修改，例如調整活化位的氨基酸序列增加適用受質的範圍及提高酵素活性，或修改酵素表面胺基酸，使酵素可以在更廣的pH值保有活性。除此之外，理性設計也包含De novo設計一個全新的人工酵素。
半理性設計則是結合隨機設計和理性設計，定向演化就是一種半理性設計，經由隨機設計取得大量的變異體後，經由功能性篩選，找出最佳的變異體。
如何用酵素生產產品?
使用酵素生產東西可以是單一酵素或多個酵素的串級反應(Enzyme cascade)，多個酵素可以組合成人工代謝路徑產生目的產物，不過將不同強度的酵素湊在有時反而會使串級反應停滯，做不出任何東西，因此需要調整代謝流(Metabolic flux)來平衡路徑上的反應。最直接的方法是調整酵素基因在宿主中的拷貝數(copy number)，可以選用不同拷貝數的質體或調整酵素基因在基因體上的重複數。另外也可以經由轉錄因子調整，給予酵素基因不同強度的啟動子(Promoter)。如果酵素基因需要的轉錄強度相同，也可以用一個啟動子一次控制多個基因表達，這種方式稱為多順反子(Polycistron)，基因之間以病毒的2A peptide序列連接，2A peptide的功能是告訴核醣體釋放前一個基因的蛋白，接續合成下一個基因的蛋白。
利用酵素生產的反應方式分為批次生產(Batch)、連續流(Continuous Flow)和微型反應槽(Microscale)。批次生產以攪拌反應槽生產，提高產量的方式是加入移除產物(In situ product removal; ISPR)及控制受質添加的功能。移除產物目的是解決產物對酵素反應的抑制性或者對細胞的毒殺性。控制受質添加則是因為受質溶解率、抑制性和毒殺性的問題。連續流生產主要用在有害物質、高反應性和不穩定分子，能夠立刻使用受質反應。微型反應槽則是將酵素或細胞鍍在表面上進行反應。酵素生產後的產物需要經過後處理分離出來，常見方法是利用管柱層析，相對比較耗時，另外也有透析、沉澱和凍乾等方法。
可以用酵素生產甚麼?
酵素可以用來生產多種產品，包含化學分子、活性醫藥成分、生質燃料、生物控制分子、聚合物和生物漂白(Biobleaching)。酵素串級反應可以用來生產化學分子，可以透過軟體設計代謝路徑產生目標化學品。生質燃料目前傾向捕捉二氧化碳轉化成高附加價值的化學分子，也有的方向是利用工程菌株生產氫氣，或者固定在電池中產生電力，都可以利用酵素達成。最近發現氣態揮發性的抗菌分子比液態或固態分子更有效，稱為微生物揮發性有機分子(microbial volatile organic compound; mVOC)，也可能透過酵素代謝生產。因為酵素具有較高的選擇性，相較於石油裂解生產，可以產出較單一的產物，適合聚合物生產。生物漂白則是利用工程微生物來將氧化態金屬還原回金屬，可能應用於廢水的金屬回收。
這篇文章濃縮了酵素發現到應用生產的完整流程，對於入門酵素科學的人都很值得一讀，是一篇堪稱教科書節別的文章。
參考文獻
Wiltschi B, Cernava T, Dennig A, Galindo Casas M, Geier M, Gruber S, Haberbauer M, Heidinger P, Herrero Acero E, Kratzer R, Luley-Goedl C, Müller C, Pitzer J, Ribitsch D, Sauer M, Schmölzer K, Schnitzhofer W, Sensen C, Soh J, Steiner K, Winkler C, Winkler M, Wriessnegger T. (2020). Enzymes revolutionize the bioproduction of value-added compounds: From enzyme discovery to special applications. Biotechnology Advances, 40, 107520. https://doi.org/10.1016/J.BIOTECHADV.2020.107520
文章連結: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975020300173