無細胞蛋白合成(Cell Free Protein Synthesis; CFPS)是非常吸引人的技術，能夠在短時間內生產所需要的蛋白，從細胞裂解液製備到進行CFPS反應生產實驗室規模1mg蛋白只需要不到一周的時間，而且細胞裂解液可以提前製備好，當需要生產蛋白時再組成CFPS反應，只需要一天就可以生產出需要的蛋白。不過要將提高產量到工業規模並且可以被廣泛應用，則需要注重批次生產的一致性，也就是針對生產過程的關鍵影響步驟進行品質管控。
Melinek et al 這篇文章分享Ipsen Biopharma、Touchlight兩家生技公司與英國CPI機構合作，優化CFPS工業化製程的結果。Ipsen Biopharma是一家專職醫藥用肉毒桿菌毒素(Botulinum)生產公司，使用CFPS技術生產肉毒桿菌毒素的優勢在於生產過程不會因為產物的細胞毒殺性影響產率。Touchlight是一家質體pDNA生產公司，以合成方式生產質體，避免pDNA殘留細菌生產過程的不純物。CPI是英國政府成立協助生技產業創新的機構。這三個組織攜手對CFPS技術工業化生產進行優化調整，將細胞萃取液生產規模提高到100L級，以及將CFPS反應提高到100mL級。CPI機構透過三個步驟優化製程: 辨認關鍵步驟、簡化步驟、優化步驟。
辨認關鍵步驟
細胞裂解液製備過程需要經過細胞培養、冷卻、沉澱細胞、清洗細胞、破裂細胞、耗盡(Run off)、透析、分裝保存等步驟。冷卻步驟目的是讓細胞停留在指數生長期，因為在這個階段細胞的代謝活性最高。耗盡步驟的目的是將內生性的mRNA被自然降解，而透析步驟則是因應耗盡步驟所使用的緩衝液不適合後續CFPS反應額外添加的步驟，目的是替換緩衝液為適合CFPS反應的成分。耗盡及透析步驟分別需要80分鐘及40分鐘，是相對較耗時的步驟。
簡化步驟
即使細胞裂解液製備的每個步驟都有其原因和目的性，對於最終蛋白質產率的貢獻度卻不盡相同，簡化步驟即是在刪除對結果影響不大的步驟，讓生產流程更簡單，便於管理和減少人員疏忽。CPI機構逐一刪去或降低製程每個步驟，檢視這些步驟對最終結果的影響，測試結果發現:
- 使用基本培養基(Minimum medium)培養的細菌，所生產的細胞萃取液完全無法進行CFPS反應。
- 冷卻步驟是保持CFPS高產率的必要步驟
- 耗盡步驟跟透析步驟對CFPS產率影響很小，可以刪除
優化步驟
CPI機構將簡化後的流程進行優化，得到得10L細胞萃取液製程如下:
- 將細菌培養至OD600=14
- 接著冷卻1小時，讓細菌停止在指數生長期
- 離心收穫細胞
- 以850bar高壓破菌
- 離心於上清液收穫細胞萃取液
- 以0.45um過濾後分裝保存於-80C直到CFPS反應
此外，100mL規模CFPS反應則是以amber250系統進行，其中擾動、溫度、pH值和氧氣濃度是影響產率的因子，不過這部分作者並沒有寫出個別參數是甚麼。
品質管控的關鍵在於辨別出管制點，並且設定容許的變動範圍。作者進行文獻回顧列出已發表文章提及會影響產率一致性的因子。針對細胞萃取液製程，影響產率最大的變因是抑制蛋白是否存在於細胞萃取液以及細胞收穫時間點。抑制蛋白指的是會干擾CFPS反應的蛋白，例如細菌中的RNase E蛋白會降解mRNA，而使CFPS反應產率變低。抑制蛋白可以透過基因改造菌株敲除基因來避免出現在細胞萃取液中，或者經由後處理移除抑制蛋白。針對CFPS反應，影響產率最大的變因是反應時間和細胞萃取液濃度。
總結
CFPS反應用於工業規模生產目前仍處於初期階段，仍需要有更多的條件測試和實驗結果來輔助工業製程的優化，CPI機構的製程提供一個參考的指標，不過並不能就成為最佳製程，隨著對CFPS反應每個步驟和因子的了解，未來將能夠更精確的保留必要步驟並提供自動化生產的參數設定。再者，這篇文章著重於細胞萃取液基底的CFPS工業化生產，主要原因為目前細胞萃取液基底的CFPS反應產率的產率遠高於PURE system，但是PURE system具有明確成分的優勢，相較於細胞萃取液更能夠掌控個別內容物的濃度，我認為當我們對無細胞轉錄-轉譯反應理解更多後，PURE system的優化結果可能超越細胞萃取液基底的CFPS反應，成為主流無細胞蛋白生產方式。
參考文獻
Melinek, B. J., Tuck, J., Probert, P., Branton, H., & Bracewell, D. G. (2023). Designing of an extract production protocol for industrial application of cell‐free protein synthesis technology: Building from a current best practice to a quality by design approach. Engineering Biology, 7(1–4), 1. https://doi.org/10.1049/ENB2.12029
文章連結: https://ietresearch.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1049/enb2.12029