定向演化(Directed Evolution)是一個讓合成生物學家著迷的技術，這個概念在2018年榮獲諾貝爾獎，實驗內容是使用嗜菌體表達無數種枯草桿菌蛋白酶變體，再以有機溶劑篩選，挑出適者生存的變體，再次變異及表達，經過多輪的汰選後，產生能夠在有機溶劑中保持活性的枯草桿菌蛋白酶。如今這個技術也以不同的方式，成功在無細胞系統中執行。
Hammerling等人開發出一種定向演化核醣體的技術平台，簡稱RISE(Ribosome synthesis and evolution)，這個技術平台結合了先前開發的iSAT技術和ribosome display技術，能夠表達無數種核醣體變體，並且汰選後還能夠定序出變體的序列資料。
iSAT技術全名是in vitro integrated synthesis, assembly and translation，是一種無細胞表達核醣體並在試管內完成核醣體自組裝的技術，其反應組成有S150 extract、報導質體、rRNA質體、70S r-protein、T7 DNA polymerase、substrate、cofactor、salts和anti-ssrA oligo。rRNA質體上帶有T7啟動子rrnB操縱子，可以被T7 DNA polymerase轉錄出23S rRNA、16S rRNA和5S rRNA，這些被表達的rRNA會自動與70S rprotein結合成為成熟的核醣體。
Ribosome display技術是利用核醣體在沒有遇到終止密碼子不會脫落的特性，產生靜止的mRNA-ribosome-peptide的三元複合體，只要將無數個這種三元複合體經過目的條件汰選，純化符合特性的三元複合體，再定序當中的mRNA，就可以得到合適的變異體序列資料。產生可以純化的mRNA-ribosome-peptide的三元複合體的方法是在報導質體上基因的上游加上3X FLAG，並在終止密碼子前加上self-cleaving hammerhead ribozyme (HH ribozyme)序列，這樣產生的mRAN會自己切掉終止密碼子，，使核醣體不會遇到終止密碼子。除此之外，細胞內還有將靜止核醣體從mRNA拆除，回收再利用的機制，這個機制是經由ssrA RNA分子執行，因此要保持靜止核醣體的狀態，還需要額外添加anti-ssrA oligo分子。
稍微不同於單純的Ribosome display技術，RISE技術平台不是定序三元複合體的mRNA，而是抽取Total RNA並反轉錄成cDNA後，以設計過的Primer夾出rRNA的區域片段進行定序。
為了證明RISE這個技術平台可行，作者設計了23S rRNA的 Clindamycin抗生素結合位的變異體庫，透過iSAT技術表達數種核醣體變體，再讓這些核醣體表達報導質體，產生mRNA-ribosome-peptide的三元複合體，經過500uM Clindamycin抗生素汰選，取得抗 Clindamycin抗生素的核醣體。作者進一步為了確認在生物體內這些核醣體也具有功能，作者將這些變異體的基因轉型到rDNA缺陷的菌株Squires strain。這種菌株的基因體本身沒有rDNA基因，只有將帶有rDNA的質體轉型到菌株中核醣體才能夠有功能。實驗結果證明被轉型的菌株能夠存活下來，並且也能在Calindamycin抗生素下生長。
RISE技術平台是創造人工核醣體的起始點，我們將有機會設計各種不同目的的核醣體變異體，例如讓核醣體在有機溶劑、超過37℃範圍或者非中性酸鹼值的嚴苛條件下還能夠保有活性，並且在無細胞系統中表達目的蛋白。
參考資料
Hammerling, M. J., Fritz, B. R., Yoesep, D. J., Kim, D. S., Carlson, E. D., & Jewett, M. C. (2020). In vitro ribosome synthesis and evolution through ribosome display. Nature Communications 2020 11:1, 11(1), 1–10. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14705-2
文章連結: https://www.nature.com/articles/s41467-020-14705-2